Os investigadores nas Universidades de Illinois desenvolveram um método para cultivar os neurônios mamíferos nas câmaras não muito maiores do que os neurônios eles mesmos. A aproximação nova estende o tempo dos neurônios em densidades muito baixas, uma etapa essencial para desenvolver um método para estudar o crescimento e o comportamento de neurónios individuais.
A técnica é descrita este mês no jornal da sociedade real da química -- Laboratório em uma microplaqueta.
“Isto que encontra será cumprimentado muito positivamente pela comunidade da neurociência,” disse Martha Gillette, que é um autor no estudo e a cabeça da pilha e do departamento de biologia desenvolvente em Illinois. “Isto está empurrando os limites do que você pode fazer com os neurônios na cultura.”
Crescer os neurônios mamíferos viáveis na baixa densidade em um ambiente artificial não é nenhuma tarefa fácil. Usar os neurônios postnatal adiciona somente ao desafio, Gillette disse, porque estas pilhas são extremamente sensíveis às circunstâncias ambientais. |
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Todos os neurônios confiam em uma fonte constante das proteínas e de outros “fatores trophic” atuais no líquido extracellular. Estes fatores são segregados pelos neurônios eles mesmos ou por pilhas da sustentação, tais como o glia. Eis porque os neurônios tendem a fazer melhor quando crescidos no alto densidade e na presença de outros neurónios. Mas uma mistura densa ou complexa das pilhas complica a tarefa de caraterizar o comportamento dos neurônios individuais.
Uma técnica para manter culturas neural vivas é crescer as pilhas em um meio que contenha o soro, ou no plasma de sangue. Isto aumenta a viabilidade das pilhas crescidas na baixa densidade, mas igualmente “contamina” a cultura, fazendo a difícil determinar que substâncias foram produzidas pelas pilhas e qual veio do soro.
Aqueles que esperam compreender as origens celulares de fatores trophic no cérebro tirariam proveito de uma técnica que permitisse que meçam as saídas químicas de pilhas individuais. A equipa de investigação fêz o progresso para este objetivo endereçando alguns obstáculos chaves.
Primeiramente, os investigadores reduziram proporcionalmente o tamanho das câmaras fluid-filled usadas para prender as pilhas. A estudante de terceiro ciclo Matthew Stewart da química fêz as câmaras pequenas fora de um gel moldado do polydimethylsiloxane (PDMS). O tamanho reduzido da câmara igualmente reduziu-se -- por diversas ordens de valor -- a quantidade de líquido em torno das pilhas, disse o diretor Center Jonathan Sweedler da biotecnologia, um autor no estudo. Esta “miniaturização de arquiteturas experimentais” facilitará identificar e medir as substâncias liberadas pelas pilhas, porque estes “releasates” são menos diluídos.
“Se você traz as paredes dentro e você faz um ambiente que pilha-esteja feito sob medida, as canaletas são agora tais que você está confinando os releasates às concentrações physiological, mesmo a nível de uma única pilha,” Sweedler disse.
Em segundo, os investigadores aumentaram a pureza do material usado para dar forma às câmaras. A pilha e o painço desenvolvente de Larry da estudante de terceiro ciclo da biologia expor o PDMS a uma série de banhos químicos às impurezas do extrato que matavam as pilhas.
O painço igualmente desenvolveu um método para gradualmente perfusing os neurônios com meios serum-free, uma técnica que reabastecesse nutrientes esgotados e removesse os produtos waste celulares. A técnica da perfusão igualmente permite que os investigadores coletem e analisem outros secretions celulares -- uma chave a identificar as contribuições bioquímicas de pilhas individuais. |
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“Nós sabemos que há os fatores que são comunicados nos meios entre as pilhas,” painço disse. “A pergunta é o que são eles, e como pode nós começ naqueles o ""
Esta combinação de técnicas permitiu a equipa de investigação de crescer extremamente os neurônios hippocampal preliminares postnatal dos ratos por até 11 dias - em baixas densidades. Antes deste trabalho, os neurônios cultivados nos dispositivos da fechado-canaleta feitos de PDMS não tratado, nativo permaneceram viáveis por dois dias no melhor dos casos.
Os neurônios cultivados igualmente desenvolveram mais axónio e as dendrites, os tendrils neural que se comunicam com outras pilhas, do que aqueles crescidos em baixas densidades com técnicas convencionais, Gillette disseram.
“Não somente para ter nós aumentamos a viabilidade das pilhas, nós igualmente aumentamos sua habilidade de diferenciar-se que olhares muito mais gostam de um neurônio maduro,” na ela dissemos.
Sweedler anotou que os sucessos da equipe são o resultado de uma colaboração original entre cientistas com fundos muito diferentes.
“(Professor da ciência e da engenharia de materiais) Ralph Nuzzo é um dos pioneiros em monolayers auto-montados e a química de superfície,” Sweedler disse. De “a perícia Martha Gillette é em compreender como estes neurônios crescem, e na imagem latente eles. Meu laboratório faz a ciência da medida muito em uma pequena escala. É quase impossível para todo o um laboratório fazer todo o isso.”
Nuzzo e Sweedler são professores de William H. e de Janet Lycan da química. Gillette é professor dos alunos da pilha e da biologia desenvolvente. Todos são apontados no instituto para a biologia de Genomic. Sweedler e Gillette são filiais do instituto de Beckman e do programa da neurociência. Sweedler é um professor no programa e em Gillette da tecnologia biológica na faculdade da medicina.
Fonte: Diana Yates
Universidades de Illinois no Urbana-Campo |
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